Exosome外泌体是细胞外泌囊泡中体积较小的一种。近几年,人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸,能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。外泌体在很多生理病理上起着重要的作用,如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能,可作为疾病诊断的生物标志物。

贝克曼库尔特公司结合自身产品线的优势,为外泌体的研究提供Exosome从富集纯化到蛋白检测的一系列配套解决方案。

点击下载:贝克曼库尔特外泌体制备和分析全面解决方案.PDF

外泌体分离纯化的金标准

超速离心分离是从生物体液和细胞培养样品中分离纯化外泌体的黄金标准,可以准确地重复获取外泌体,同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化。

外泌体离心纯化标准流程

差速离心富集法

密度梯度离心法

点击视频查看外泌体分离操作流程

点击下载:介绍外泌体来源RNA的外泌体分离和测序方案.PDF

贝克曼超速离心分离纯化外泌体的优势:

> > > 用贝克曼超离可以有效清除FBS中的外泌体,减少干扰要素。

> > > 贝克曼超离增添新功能;g-Max满足不同体积的分离,离心效率更高。

世界各地的研究人员正开始采集和处理外泌体和其他细胞外囊泡 (EV) 所包含的信息。要全面解读外泌体所含信息,必须首先了解外泌体的形成、转运和转移。虽然外泌体和其他EV的基础研究尚属新兴领域,但却在日益发展。

欢迎查看如下网络研讨会了解外泌体研究大咖们正在进行的部分基础工作:

Exosome小颗粒,大世界(英文应用讲座)

在此处网络研讨会中,作为最早一批发现外泌体内含有mRNA等物质的专家,Lotvall博士介绍了细胞培养物中和体内外泌体的多样性,以及它们如何参与细胞间通讯并影响肿瘤微环境

观看讲座

Exosome:功能那么强,提取并不难(中文应用讲座)

在此次网络研讨会中,贝克曼库尔特离心机产品经理霍德华与您分享如何优化外泌体离心过程中的各个细节,使之发挥出最优的分离纯化效果,让您轻松得到高质量的外泌体。

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展开想象的翅膀,外泌体研究将把我们带往何方?

迄今,对于外泌体研究的未来可能会产生什么,我们已经在外泌体研究过程中得到了饶有趣味的提示,但仍需开展更多研究。所幸,这类研究正在进行中,有关外泌体的答案即将揭晓。

欢迎查阅如下的网络研讨会,了解该领域研究人员认为外泌体研究将把我们带往何方的相关信息。


Exosome为肿瘤临床诊断和治疗带来新的契机(英文应用讲座)

在此网络研讨会中,Di Vizio博士解释癌症来源外泌体(又 称“癌小体”)在癌症恶化和转移中的作用,以及它们用作治疗反应和缓解生物标记物的可能性。

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Exosome揭秘干细胞与免疫细胞如何“对话”(英文应用讲座)

在此网络研讨会中,Pluchino博士讲解了外泌体与神经干细胞和神经元前体细胞发生信号传导的情况,以及它们在神经炎性疾病中的作用。此外,他还谈及外泌体靶向治疗的未来。

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其他相关视频

>>> Mathivanan博士探讨外泌体和核外颗粒体之间的相似性和差异性,包括外泌体和肿瘤发生之间的高度相关性。

>>> Gould博士讨论外泌体的生物起源以及蛋白质和病毒的出芽。

>>> Principe博士对源自口腔癌(OC)的癌相关成纤维细胞(CAF)的研究进行回顾,并详述癌细胞转移相关基因的外泌体富集证据。

>>> Kislinger博士和Lyden博士分享了他们的外泌体研究,以及对它们如何帮助塑造肿瘤微环境的看法,他们还讨论了细胞间的外泌体通讯以及它是否是可行的治疗靶点。

外泌体作为细胞间信息传导的媒介,在癌症等疾病的预防、诊断、治疗领域发挥着重要作用; 为了有效的识别,区分外泌体亚群,开发一套科学合理的分离方法提取外泌体对于后续研究的开展尤为关键!以下是根据日本癌症研究所蛋白质工程部Kiyotaka Shiba博士团队关于密度梯度离心法在外泌体亚类分析中的应用访谈中的精华摘要内容。

纯化方法的选择

当前有多种纯化提取外泌体的方法, 诸如PEG试剂盒、免疫提取等, 但很多试剂盒的成分及分离原理都未有效披露,由于研究的是外泌体的亚群分类,Kiyotaka Shiba博士团队更倾向于选择超速离心的方法,它能够全面有效的收集所需的外泌体而不会错失任何的数据。

介质液的选择

由于利用的是基于密度开展的平衡密度梯度离心法,样品在介质液中的平衡状态比较重要。因此在离心实验前,他们先试用了两种密度介质液(OptiPrep 碘克沙醇 & 蔗糖液)检测样品的上浮或下沉的平衡点一致性(参见Fig.1),最终选定OptiPrep碘克沙醇作为介质液。


Fig.1 平衡验证

利用水平转头纯化

在样品分离纯化阶段,Kiyotaka Shiba博士团队先用超声波预处理唾液样品,降低其粘度对于后续离心实验的干扰,2,600xg离心取上清。然后使用贝克曼超离Optima L-90K搭配经典的水平转头SW32 Ti(使用38.5ml规格的超净离心管),在4℃条件下160,000xg,离心70 min。为了进一步获得更纯的外泌体样品,将离心后得到的沉淀重悬于相应的缓冲液中,而后置于不同密度梯度的碘克沙醇介质液中,运用水平转头SW 41(内置14ml装的超净离心管),在4℃条件下,160,000xg,离心17h,将收集的样品通过纳米追踪分析仪(NTA), Western blot以及原子力显微镜(AFM)进一步验证。(具体实验流程见Fig.2)


Fig.2 利用水平转头的平衡密度梯度离心法

利用定角转头纯化

为了加大超离处理样品的通量,Kiyotaka Shiba博士团队又选用贝克曼的台式超速离心机Optima MAX-XP搭配TLA-110定角转头进行相应的离心实验。样品的通量由原先水平转头上的4管或6管分别提升到 6至8管。同时离心时间也大大缩短,原先用水平转头一天只能纯化一次,现在一天能分离两批。纯化的效果较之水平转头也很类似。(具体流程参见Fig.3)


Fig.3 利用定角转头的平衡密度梯度离心法

纯化后的外泌体处理

最后,Kiyotaka Shiba博士团队分享了两点处理纯化后的外泌体的宝贵经验:
1、如何减少纯化后的外泌体粘附于管壁或吸头造成的损失?
外泌体样品的粘附管壁是不可避免的,为了减少这一损失,他们省略了纯化后样品清洗这一步,直接拿去做检测分析,但是在分析的时候不可忽略外泌体所处的缓冲液的条件。
2、如何有效的保存纯化好的外泌体样品,降低颗粒及其活性的损失?
高度纯化的外泌体对于存储条件非常敏感,冷冻会导致微粒的损失;Kiyotaka Shiba博士团队的方法是将纯化后的样品分成不同的比例;一部分样品只冻存一次,另外一部分样品冻存两次,根据不同的实验要求选用相应的批次;保存方法选用的是液氮,-80℃条件下冻存。

 

样本准备

1.问:外泌体分离需要多少起始材料?

答:成功分离外泌体所需的起始材料,取决于你所研究的体液、所选择的分离方法以及将进行的下游分析。外泌体的浓度随体液类型和疾病状态而异。最好对目标体液和疾病所涉及的外泌体浓度进行评估。知道样品所含外泌体的浓度之后,你还需要了解自己所选外泌体分离方法的效率,你可以采用标准化外泌体样品或微球进行计算。 然后可以反推计算达到n所需的总体积,其中考虑到样品损耗和外泌体裂解引起的外泌体损耗。成功分离外泌体后,你希望确保所选下游分析具备足够的起始材料(DNA、RNA、蛋白质)。现有方案的初始体积范围最低为3~4mL,最高为50+mL。

制备方法

2.问:贝克曼用什么方法分离外泌体,以及如何表征这种混合的外泌体群体?

答:贝克曼库尔特建议,过滤后采用低转速除去完整细胞、细胞碎片和大聚集体。使用转头速度超过100,000×g 的贝克曼超速离心机高速离心处理2小时以上,可以沉淀、浓缩外泌

如需对外泌体群体进一步纯化分离,建议以转速为100,000×g的5~40% 碘克沙醇非连续性密度梯度离心法处理18小时以上。分离外泌体并确认其回收率之后,在台式超速离心机中以超过100,000×g的转速处理外泌体1.5~2小时,即可令外泌体沉淀。外泌体群体一般通过光散射法、二代基因测序法及蛋白质印迹法进行表征。

工作流示例可参阅我们的应用注解《利用贝克曼库尔特仪器对外泌体进行分离和表征的标准自动化方法》

存储条件

3. 问:你是否可以告知样品储存条件(包括从不同来源分离出来的外泌体温度),以及外泌体分离前生物体液和细胞培养样品的储存条件?

答:贝克曼建议,经常使用的纯化外泌体储存在 -20℃ 条件下,而长期储存的温度则为 -80℃。我们尚未发现不同外泌体来源在储存条件影响方面存在任何差异。

大多数生物体液(尿液、精液、唾液等)可以在分离外泌体之前存放于 -80℃ 条件下。对于细胞培养,大多数细胞系在37℃、5% CO2 条件下储存。

贝克曼建议,非培养条件下细胞系的储存温度为 -80℃。通过细胞培养分离外泌体的方案示例可参阅我们的应用注解《利用贝克曼库尔特仪器对外泌体进行分离和表征的标准化自动化方法》

利用定角转头纯化

4. 问:以超速离心法分离外泌体,蛋白质、DNA和RNA产量一般是多少?

如果我们进行以下操作,总共需要花多长时间?

1、从细胞培养基和血浆中提取外泌体
首先是3个不同的沉淀步骤,共需2个小时,接着进行隔夜密度梯度离心步骤,目的是分离出细胞培养基或血浆中的外泌体。

2、RNA分离、NGS和分析
用Biomek 4000分离RNA约花费3小时,接着是特定RNA类型的富集(供NGS使用)。NGS和分析高度取决于所采用的系统和所进行的分析类型。

 

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