高冠军

“CRISPR基因编辑是目前解决IncRNAs功能最强有力的方法之一”

作为世界上最早探索CRISPR基因编辑技术的一批科研人员之一,高冠军教授曾在2013-2014年分别在国际遗传学经典期刊上发表一系列方法学论文,其带领课题组在国际上率先建立起CRISPR与phiC31重组酶相结合的高效果蝇基因打靶系统,已广泛地应用于国内外的众多果蝇实验室中。
目前高冠军研究小组将优化后的CRISPR技术运用于lncRNA 活体功能研究领域,并开启了lncRNA这一“暗物质”所传递的生命信息的大门。

Shengwu 360精选了高冠军教授在2014-2016年发表的4篇文章,翻译摘要以供读者更好的了解其工作成果。由于编辑个人翻译水平有限,如有错误感谢您的指正。

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Wen, K., Yang, L., Xiong, T., Di C, Ma, D., Wu, M.,... Gao, G. (2016). Critical roles of long noncoding RNAs in Drosophila spermatogenesis. [Journal Article]. Genome Res, 26(9), 1233-1244. doi: 10.1101/gr.199547.115)(注:开源paper可下载)

长链非编码RNA在果蝇精子发生中的关键作用

摘要:
长链非编码RNA(lncRNA),最新发现的一类细胞内RNA,在许多细胞发育过程的调节中发挥重要作用。尽管lncRNAs已在不同系统中进行了系统性的鉴定,但在活体动物模型中,大部分的lncRNAs 没有得到功能上的表征。在这项研究中,我们确定128个睾丸特异性的果蝇lncRNAs,并使用了一种优化的三组分CRISPR / Cas9系统,敲除了其中105个lncRNAs。在lncRNA敲除的果蝇中,有33(31%)只显示丧失了部分或完全的雄性生育能力,晚期伴随出现视觉发育缺陷。此外,6只经敲除的果蝇通过一种反式构型的转基因,得以完全或部分的修复,表明这些lncRNA主要是反式发挥作用。另外,5个lncRNA突变体的基因表达谱表明,睾丸特异性lncRNAs调节着总体的基因表达,从而协调晚期男性生殖细胞分化。与编码基因相比,睾丸特异性lncRNAs进化地更快。并且,功能更强大的 lncRNA,其序列保守性更高,这表明它们在不断进化选择。总而言之,我们的研究结果揭示了快速演变的睾丸特异性lncRNAs在果蝇精子发生后期的关键功能。

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Xue Z, Wu M, Wen K, Ren M, Long L, Zhang X. & Gao G*. CRISPR/Cas9 Mediates Efficient Conditional Mutagenesis in Drosophila. G3:Genes|Genomics| Genetics. 2014 Sep 5. pii: g3.114.014159.

CRISPR / Cas9介导果蝇的有效条件诱变

摘要:
现有的转基因RNA干扰(RNAi)方法通过在果蝇中靶向沉默mRNA,极大的促进功能基因组的研究。尽管RNAi方法非常有用,但其低效率仍然令人堪忧。这里,我们将由Gal4/上游激活位点系统驱动的组织特异性表达的Cas9,同多种普遍表达诱导的RNA转基因集合,获得一种CRISPR/Cas介导的条件性突变系统,从而在时间和空间上有效控制关闭基因的表达。此外,通过在转基因载体中包含多个指导RNA来靶向单个基因,我们在特定组织中实现了高度的基因突变。 CRISPR / Cas9介导条件诱变系统为基因功能分析提供了一个简单和有效的工具,并补充了现有的RNAi方法。

3

Xue Z, Ren M, Wu M, Dai J, Rong YS. & Gao G*. Efficient gene knock-out and knock-in with transgenic Cas9 in Drosophila. G3:Genes|Genomics| Genetics. 2014 Mar 21; 4(5):925-9.(注:开源paper可下载)

在果蝇中使用转基因Cas9有效进行基因敲除和敲入

摘要:
细菌Cas9核酸酶通过以小gRNA作为指导,诱导特定位点的DNA断裂。Cas9已能成功在果蝇中完成基因编辑。这里我们通过开发一种能在果蝇种系表达Cas9的转基因系统,从而提高了这种方法的多功能性。通过这个系统,我们仅将gRNA注射到胚胎中,诱导遗传敲除突变,并通过新型非编码RNA基因的启动子表达gRNA,实现了高效突变,并恢复了基于同源重组的荧光标记的敲入,其通过环装DNA供体共注射gRNA的速率达4.5%。

4

Wei W, Xin H, Roy B, Dai J, Miao Y. & Gao G*. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 in the silkworm, Bombyx mori.  PLoS One. 2014 Jul 11; 9(7):e101210.(注:开源paper可下载)

使用CRISPR/Cas9在蚕中进行的可遗传的基因组编辑

摘要:
在此项研究中,我们通过在蚕中使用经修饰的规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)和相关蛋白(Cas9)系统,建立了一种有效并且可遗传的基因突变方法。以4个位点Bm-okBmKMOBmTH, 和Bmtan为实验对象,我们证明了将特定导向RNA和Cas-mRNA直接的显微注射入蚕胚胎中,能够诱发特定位点的基因突变。在注射的子一代中观察到16.7-35.0%的突变频率,也存在着DNA片段的缺失。由于Bm-ok破坏细胞,半透明的表皮表型容易被鉴定,我们用Bm-ok嵌合突变体来检测突变遗传特性。我们使用了2个交叉实验。第一个实验,将注入了Bm-ok的飞蛾与野生型飞蛾杂交,种系突变传递的频率为28.6%。第二个实验,将2个Bm-ok嵌合突变的飞蛾相互杂交,93.6%的子代的Bm-ok(复合杂合子)的两个等位基因均出现突变。总之,CRISPR/Cas9系统可以作为蚕娥种系的一种高度特异性和可遗传的基因编辑工具。

如您对高冠军教授的研究非常关注,请您关注即将在2017年3月24、25日在上海举办的“基因编辑专题研讨会”。高冠军教授将在会议上就他的研究同各位做深入探讨。

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